Протеиназа К - сериновая протеаза, обладающая широким спектром специфичности.
Наиболее активно гидролизует пептидную связь прилежащую к карбоксильной группе алифатических и ароматических аминокислот.
Используется для гидролиза белковых примесей различной природы и инактивации нуклеаз в препаратах НК, а также для повышения эффективности лизиса тканей и клеток в процедурах экстракции НК.
Характеристики:
молекулярная масса 18,5 kDa;
максимальная активность при рН 8,0;
рабочая концентрация фермента 20-200 мкг/мл
проявляет активность в растворах с большим диапазоном значений pH (4.3-12.5), и в широком диапазоне температур – 20-65°C;
способна сохранять активность в присутствии ЭДТА (0.5 M), GuHCl (3 M), мочевины (4 M), Tween 20 (5%), Triton X-100 (1%), SDS (0,5%);
ионы кальция стабилизируют фермент, однако в отсутствие ионов Ca2+ фермент проявляет около 20% исходной активности, как правило, этого достаточно для деградации белков, обычно присутствующих в препаратах НК;
ингибируется фенилметилсульфонилфлюоридом (PMSF), диизопропилфосфорофлюоридат (DFP), EGTA
Поставляется в лиофилизированном виде вместе с буфером для разведения.
Пример проведения реакции
Денатурация белка. Обработайте образец в 6М GuHCl или в 6М мочевине, 50mM TrisHCl, pH 8,0, 2-5 mM DTT при 60°С 45-60 мин. Охладите образец, а затем разведите его на буфере 50 mM Tris-HCl (pH 7.5); 5 mM CaCl2 до концентрации GuHCl или мочевины 2М и меньше.
Обработка протеиназой К. Добавьте протеиназы К до конечной концентрации 50-100 мкг/мл. Инкубируйте при 37-56°С не менее часа. Инактивируйте фермент при 75°С в течение 10-15 мин.
Отдельно можно приобрести СПК-буфер - буфер для предобработки сухих пятен крови.
